生物安全与来源:生物安全等级为 1 级(BSL-1),无致病性,属于人类肠道正常菌群(非致病菌株),虽对部分抗菌药物具有耐药性,但常规实验室规范操作(超净台接种、无菌耗材使用、操作后器具灭菌)下,对操作人员及环境无危害。该菌株分离自临床非感染性肠道样本,经长期验证,其耐药表型(对喹诺酮类、氨基糖苷类耐药,对部分 β- 内酰胺类敏感)从未漂移,能精准模拟临床常见多药耐药大肠杆菌的药敏特征,是连接多药耐药检测与临床合理用药的核心参照。
形态与培养特性:属于革兰氏阴性短杆菌,具有肠杆菌科典型形态与高适应性培养特征:
显微镜形态:菌体呈短杆状,直径 0.5-1.0μm,长度 1.0-2.0μm,常单个或成对排列,无芽孢,具有周生鞭毛(运动能力均一,鞭毛染色后形态稳定),革兰氏染色呈均匀红色(无着色不均,可与其他革兰氏阴性杆菌快速区分);
培养要求:对营养需求极低,在普通营养琼脂(NA)、胰酪大豆琼脂(TSA)、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂(EMB)及 LB 琼脂中均能快速生长;兼性厌氧,最适生长温度 37℃(与人体体温适配),可耐受 10-45℃温度范围,生长速度稳定(37℃培养 16-18 小时菌落直径达 2-3mm),无延迟生长期,确保不同批次实验结果的重复性;
菌落形态:在 TSA 平板上,形成圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、乳白色不透明菌落(直径 2-3mm,大小均一);在麦康凯琼脂上,因发酵乳糖产酸,菌落呈鲜艳粉红色(无颜色深浅差异);在 EMB 琼脂上,菌落呈紫黑色且带有清晰金属光泽(大肠杆菌标志性特征);在含环丙沙星(1μg/mL)或庆大霉素(4μg/mL)的选择性培养基上,能正常生长(耐药特性直观体现),而敏感菌株(如 ATCC25922)则无法生长,可快速区分耐药与敏感菌株。
生化与耐药特性:生化反应具有 “标准化” 稳定性,与非耐药大肠杆菌一致:能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等糖类产酸产气(发酵速度与产气量均一,无批次差异);触酶试验阳性、氧化酶试验阴性;吲哚试验阳性、甲基红试验阳性、V-P 试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性(IMViC 试验结果 “++--”,无任何变异);不产生硫化氢,不分解尿素。核心优势在于稳定的多药耐药表型:经 CLSI(美国临床和实验室标准协会)标定,该菌株对喹诺酮类药物(环丙沙星、左氧氟沙星)耐药(环丙沙星 MIC≥4μg/mL),对氨基糖苷类药物(庆大霉素、阿米卡星)耐药(庆大霉素 MIC≥16μg/mL),对头孢三代药物(头孢曲松、头孢他啶)敏感(头孢曲松 MIC≤1μg/mL),对青霉素类药物(氨苄西林)中度敏感,每种药物的 MIC 值均有明确标准范围,是多类抗菌药物联合药敏检测的 “基准标尺”。
未开封状态:产品主要以冻干粉(真空密封包装,含 10^7-10^8 CFU / 支活菌,含耐药表型保护剂) 或标准化甘油菌悬液(20% 甘油,10^6 CFU/mL,-80℃专用) 形式供应:
冻干粉:未开封时需置于 - 20℃以下冷冻保存,长期储存(超过 1 年)建议放入 - 80℃冰箱,严禁反复冻融(反复冻融会使活菌率下降 60% 以上,破坏耐药表型稳定性);保质期以 ATCC 官方标注为准,通常为 5 年(专用保护剂可维持耐药基因稳定,避免表型漂移);
甘油菌悬液:未开封时需直接置于 - 80℃冷冻保存,不可室温或冷藏放置,保质期 2 年;解冻时需 37℃水浴快速溶解(1 分钟内),解冻后需一次性使用,剩余菌液需灭菌后丢弃,不可再次冷冻(避免耐药基因表达异常,导致药敏结果偏差)。
复苏后状态:复苏后的菌液(TSB 肉汤培养)需 2-8℃冷藏保存,建议 5 天内使用完毕(代谢稳定,冷藏期略长于普通菌株);复苏后的斜面培养物(TSA 斜面)需 2-8℃冷藏保存,建议 2 周内传代一次,传代时需使用无抗菌药物的新鲜培养基(避免药物残留诱导耐药性增强或减弱);使用前需通过涂片镜检(确认菌体形态正常,无肿胀、畸形)及药敏预实验(验证对环丙沙星、庆大霉素的耐药性及对头孢曲松的敏感性符合标准范围),确保耐药表型无漂移。
复苏操作:
冻干粉复苏:无菌环境下(超净台内),向冻干粉中加入 1mL 无菌胰酪大豆肉汤(TSB,需确认无抗菌药物污染),轻轻吹吸 5 次使粉末完全溶解,转移至无菌试管,37℃培养箱振荡培养(180rpm)14-16 小时;待菌液 OD600 值达 0.5-0.7(对数生长期中期,耐药表型最稳定)、镜检可见均一短杆菌时,即可用于实验;
甘油菌复苏:从 - 80℃取出后立即 37℃水浴解冻,用无菌枪头吸取 100μL 菌液接种至 5mL TSB 肉汤,37℃振荡培养 14-16 小时,待菌液浑浊后使用,无需再次稀释(浓度已标准化,适配多药联合药敏实验需求)。
传代培养:在超净台内,用无菌接种环蘸取少量复苏菌液,在 TSA 平板上分区划线(确保单菌落分离,避免杂菌污染),37℃培养 16-18 小时;挑取形态典型(圆形、乳白色、光滑)的单菌落,可直接用于 AST 实验,或转接至 TSA 斜面(37℃培养 20 小时),2-8℃冷藏保存;传代次数严格控制在 3 代以内(避免长期传代导致耐药基因丢失或突变,影响药敏表型),每次传代后需通过环丙沙星、庆大霉素及头孢曲松的药敏实验验证耐药特性,确保菌株质量符合质控标准。
应用操作:
临床多药 AST 质控:作为 CLSI 推荐的 “多类抗菌药物药敏质控菌株”,用于验证全自动药敏分析仪(VITEK 2、BD Phoenix)、药敏试纸条、微量肉汤稀释法对多药耐药大肠杆菌的检测准确性,如确认环丙沙星 MIC 值在 4-16μg/mL、庆大霉素 MIC 值在 16-64μg/mL、头孢曲松 MIC 值在 0.25-1μg/mL,偏离则需校准设备或更换试剂,是临床区分多药耐药与敏感菌株、指导喹诺酮类及氨基糖苷类药物使用的 “把关菌株”;
微生物鉴定验证:作为阳性对照,验证生化鉴定试剂盒(API 20E)、微生物质谱检测系统(MALDI-TOF MS)对多药耐药大肠杆菌的鉴定能力,确保临床样本中多药耐药大肠杆菌与其他肠道致病菌(如肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌)的正确区分,避免因鉴定失误导致的用药偏差;
耐药机制研究与药物筛选:在科研领域,用于探索喹诺酮类耐药基因(如 gyrA、parC)、氨基糖苷类耐药基因(如 aac (3)-Ⅱ)的表达调控机制,同时可作为筛选针对多药耐药大肠杆菌新型药物(如新型喹诺酮类衍生物、氨基糖苷类修饰酶抑制剂)的标准菌株,通过对比药物对该菌株与敏感菌株(ATCC25922)的抑制效果,评估药物抗多药耐药活性;
教学与方法验证:在微生物教学中,用于演示多药耐药菌株的药敏实验操作,对比敏感菌株与多药耐药菌株对不同类别抗菌药物的药敏结果差异;同时可用于实验室新多药耐药检测方法(如多重 PCR 检测耐药基因)的验证,确保方法的特异性与灵敏度,为临床多药耐药检测提供技术支持。


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